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SchmidtNathan Moore, John R. Chevillet, … Kenneth KotzMiaorong Yu, Lu Xu, … Huajian GaoScientific Reports Band 12, Artikelnummer: 9000 (2022 ) Diesen Artikel zitierenGenvektoren zur Behandlung von Mukoviszidose-Lungenerkrankungen sollten auf die leitenden Atemwege ausgerichtet werden, da die periphere Lungentransduktion keinen therapeutischen Nutzen bietet.Die virale Transduktionseffizienz steht in direktem Zusammenhang mit der Vektorverweilzeit.Zugeführte Flüssigkeiten wie Genvektoren breiten sich jedoch während der Inspiration auf natürliche Weise in die Alveolen aus, und therapeutische Partikel jeglicher Form werden schnell über den mukoziliären Transit ausgeschieden.Die Verlängerung der Verweildauer des Genvektors in den leitenden Atemwegen ist wichtig, aber schwer zu erreichen.Mit Genvektoren konjugierte magnetische Partikel, die zu den leitenden Atemwegsoberflächen geleitet werden können, könnten die regionale Ausrichtung verbessern.Aufgrund der Herausforderungen der In-vivo-Visualisierung ist das Verhalten solch kleiner magnetischer Partikel auf der Atemwegsoberfläche in Gegenwart eines angelegten Magnetfelds kaum bekannt.Das Ziel dieser Studie war es, Synchrotron-Bildgebung zu verwenden, um die In-vivo-Bewegung einer Reihe magnetischer Partikel in der Luftröhre von anästhesierten Ratten zu visualisieren, um die Dynamik und Muster des Verhaltens einzelner und großer Partikel in vivo zu untersuchen.Wir haben dann auch untersucht, ob die Abgabe von lentiviralen Magnetpartikeln in Gegenwart eines Magnetfelds die Transduktionseffizienz in der Luftröhre der Ratte erhöht.Synchrotron-Röntgenbildgebung zeigte das Verhalten magnetischer Partikel in stationären und sich bewegenden Magnetfeldern, sowohl in-vitro als auch in-vivo.Partikel konnten mit dem Magneten nicht einfach entlang der aktiven Atemwegsoberfläche gezogen werden, aber während der Abgabe wurde die Abscheidung innerhalb des Sichtfelds fokussiert, wo das Magnetfeld am stärksten war.Die Transduktionseffizienz wurde auch um das Sechsfache verbessert, wenn die lentiviral-magnetischen Partikel in Gegenwart eines Magnetfelds abgegeben wurden.Zusammen zeigen diese Ergebnisse, dass lentivirale Magnetpartikel und Magnetfelder ein wertvoller Ansatz sein können, um das Genvektor-Targeting zu verbessern und die Transduktionsniveaus in den leitenden Atemwegen in vivo zu erhöhen.Zystische Fibrose (CF) wird durch Varianten in einem einzigen Gen verursacht, das CFTR (Transmembrane Conductance Regulator) genannt wird.Das CFTR-Protein ist ein Ionenkanal, der in vielen Epithelzellen im ganzen Körper vorhanden ist, einschließlich der leitenden Atemwege, dem primären Ort der CF-Pathogenese.Der CFTR-Defekt führt zu einem anormalen Wassertransport, der die Atemwegsoberfläche dehydriert und die Tiefe der Schicht der Atemwegsoberflächenflüssigkeit (ASL) verringert.Dies beeinträchtigt auch die Fähigkeit des mukoziliären Transitsystems (MCT), eingeatmete Partikel und Krankheitserreger aus den Atemwegen zu entfernen.Unsere Ziele sind die Entwicklung einer lentiviralen (LV) Gentherapie, um eine korrekte Kopie des CFTR-Gens zu liefern und die ASL, MCT und Lungengesundheit zu verbessern, und die Entwicklung neuartiger Techniken, mit denen diese Parameter in vivo gemessen werden können1.LV-Vektoren sind einer der Hauptkandidaten für eine CF-Atemwegs-Gentherapie, vor allem weil sie das therapeutische Gen dauerhaft in Atemwegs-Basalzellen, eine Stammzelle der Atemwege, integrieren können2.Dies ist wichtig, da sie dann einen lebenslangen Nutzen bringen könnten, indem sie sich in funktionelle genkorrigierte CF-relevante Atemwegsoberflächenzellen differenzieren, die die normale Hydratation und Schleimbeseitigung wiederherstellen1.LV-Vektoren sollten auf die leitenden Atemwege abzielen, da dies der Ort ist, an dem die CF-Lungenerkrankung beginnt.Das Einbringen von Vektoren tiefer in die Lunge könnte eine alveoläre Transduktion bewirken, aber dies bietet keinen therapeutischen Nutzen für CF.Flüssigkeiten wie Genvektoren bewegen sich jedoch während der Inspiration nach der Geburt auf natürliche Weise in die Alveolen3,4, und therapeutische Partikel werden über MCT schnell in den Mund abgegeben.Die LV-Transduktionseffizienz steht in direktem Zusammenhang mit der Zeitdauer, die der Vektor neben den Zielzellen verbleibt, um die zelluläre Aufnahme zu ermöglichen – die „Verweilzeit“5 – die durch typische regionale Luftströme und die koordinierte Aufnahme von Partikelschleim und MCT leicht reduziert wird.Für CF ist die Möglichkeit, die LV-Verweilzeit in den leitenden Atemwegen zu verlängern, wichtig, um in dieser Region ein hohes Maß an Transduktion zu erreichen, war bisher jedoch eine Herausforderung.Um diese Barriere zu überwinden, schlagen wir vor, dass LV-Magnetpartikel (MP) auf zwei sich ergänzende Weise hilfreich sein können.Erstens könnten sie magnetisch zu den leitenden Atemwegsoberflächen geführt werden, um das Zielen zu verbessern und den Genvektorpartikeln dabei zu helfen, sich in den gewünschten leitenden Atemwegsregionen aufzuhalten;und zweitens kann die magnetische Kraft auch die LV-Vektorpartikel dabei unterstützen, sich durch die Oberflächenschichten (Schleim, Sekrete und ASL) zur Zellschicht zu bewegen6.MP wurden in der Krebstherapie ausgiebig als zielgerichteter Wirkstofftransportvehikel verwendet, wenn sie mit Antikörpern, Chemotherapeutika oder anderen kleinen Molekülen konjugiert wurden, die sich an Zellmembranen anheften oder an relevante Zelloberflächenrezeptoren binden und sich in Gegenwart eines statischen Mittels an der Tumorstelle ansammeln Magnetfeld7.Andere „hyperthermische“ Techniken dienen dazu, das MP aufzuheizen, wenn es einem oszillierenden Magnetfeld ausgesetzt wird, wodurch die Tumorzellen zerstört werden.Das Prinzip der Magnetofektion, bei der das Magnetfeld wie ein Transfektionsmittel verwendet wird, um den DNA-Transfer in Zellen zu verbessern, wird üblicherweise in-vitro für schwer zu transduzierende Zelllinien unter Verwendung einer Reihe von nicht-viralen und viralen Genvektoren eingesetzt8.Die Wirksamkeit der LV-Magnetofektion wurde nachgewiesen, wobei LV-MP in vitro in Gegenwart eines statischen Magnetfelds an eine menschliche bronchiale Epithelzelllinie abgegeben wird und die Transduktionseffizienz im Vergleich zum LV-Vektor allein um das 186-fache erhöht9.LV-MP wurden auch auf In-vitro-CF-Modelle angewendet, wobei die Magnetofektion die LV-Transduktion von Luft-Flüssigkeits-Grenzflächenkulturen in Gegenwart von CF-Sputum um das 20-fache erhöhte10.Allerdings hat die In-vivo-Magnetofektion von Organen vergleichsweise wenig Aufmerksamkeit erfahren und wurde nur in einer kleinen Anzahl von Tierstudien untersucht11,12,13,14,15, mit noch weniger speziell in der Lunge16,17.Nichtsdestotrotz ist die Möglichkeit einer Magnetofektion bei der CF-Lungenbehandlung klar.Tanet al.(2020) stellten fest, dass „Proof-of-Concept-Studien zur effektiven Verabreichung magnetischer Nanopartikel in die Lunge den Weg für zukünftige CFTR-Inhalationsstrategien ebnen werden, um die klinischen Ergebnisse bei Patienten mit CF zu verbessern“6.Das Verhalten kleiner magnetischer Partikel auf der Atemwegsoberfläche in Gegenwart eines extern angelegten Magnetfelds ist schwer zu visualisieren und zu untersuchen und daher kaum bekannt.In anderen Studien haben wir auf Synchrotronausbreitung basierende Phasenkontrast-Röntgenbildgebungsverfahren (PB-PCXI) zur nicht-invasiven Visualisierung und Quantifizierung winziger In-vivo-Änderungen der ASL-Tiefe18 und des MCT-Verhaltens19,20 entwickelt, um die Atemwegsoberfläche direkt zu messen Flüssigkeitszufuhr und zur Verwendung als Frühindikatoren für die Wirksamkeit der Behandlung.Darüber hinaus verwendet unsere MCT-Bewertungsmethode Partikel mit einem Durchmesser von 10–35 µm, die aus Aluminiumoxid oder Glas mit hohem Brechungsindex bestehen, als MCT-Marker, die mit PB-PCXI21 sichtbar sind.Beide Techniken sind an die Visualisierung einer Reihe von Partikeltypen, einschließlich MP, anpassbar.Aufgrund ihrer hohen räumlichen und zeitlichen Auflösung sind unsere PB-PCXI-basierten ASL- und MCT-Analysetechniken ideal für die Anwendung auf die Untersuchung der Dynamik und Muster des Verhaltens einzelner und großer Partikel in vivo, um unser Verständnis und die Optimierung von MP zu unterstützen Technologien für die Genübertragung.Der Ansatz, den wir hier verwenden, folgt auf Studien, die wir mit der SPring-8 BL20B2-Beamline durchgeführt haben, in denen wir die Flüssigkeitsbewegung nach der Abgabe einer Scheinvektordosis in die Nasen- und Lungenluftwege von Mäusen visualisiert haben, um die Muster der ungleichmäßigen Genexpression zu erklären, die wir dabei beobachten unsere Genvektordosierungs-Tierstudien3,4.Das Ziel der vorliegenden Studie war die Verwendung von Synchrotron PB-PCXI zur Visualisierung der In-vivo-Bewegung einer Reihe von MP in der Luftröhre lebender Ratten.Diese PB-PCXI-Bildgebungsstudien wurden entwickelt, um eine Reihe von MP, Magnetfeldstärken und Orten zu testen, um ihre Auswirkungen auf die MP-Bewegung festzustellen.Wir stellten die Hypothese auf, dass das extern angelegte Magnetfeld dem abgegebenen MP helfen würde, in der Zielregion zu bleiben oder sich in diese zu bewegen.Diese Studien ermöglichten es uns auch, die Magnetkonfiguration zu identifizieren, die die Anzahl der Partikel maximierte, die nach der Ablagerung in der Luftröhre zurückgehalten wurden.In einer zweiten Studienreihe versuchten wir, diese optimale Konfiguration zu verwenden, um die Transduktionsmuster zu demonstrieren, die sich aus der LV-MP-Abgabe in die Atemwege von Ratten in vivo ergeben, basierend auf der Hypothese, dass die Abgabe von LV-MP in Gegenwart eines Atemwegs zielgerichtet ist Magnetfeld würde zu einer verbesserten LV-Transduktionseffizienz führen.Alle Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die von der University of Adelaide (M-2019-060 und M-2020-022) und den Ethikkommissionen für SPring-8 Synchrotron genehmigt wurden.Die Experimente wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.Die gesamte Röntgenbildgebung wurde an der BL20XU-Beamline am SPring-8-Synchrotron in Japan unter Verwendung eines ähnlichen Aufbaus wie zuvor beschrieben durchgeführt21,22.Kurz gesagt befand sich die Versuchshütte 245 m vom Synchrotron-Speicherring entfernt.Für die Partikelbildgebungsstudien wurde ein Abstand von Probe zu Detektor von 0,6 m und für die In-vivo-Bildgebungsstudien von 0,3 m verwendet, um Phasenkontrasteffekte zu erzeugen.Es wurde eine monochromatische Strahlenergie von 25 keV verwendet.Bilder wurden mit einem hochauflösenden Röntgenkonverter (SPring-8 BM3) aufgenommen, der mit einem sCMOS-Detektor gekoppelt war.Der Konverter verwendete einen 10 µm dicken Szintillator (Gd3Al2Ga3O12), um Röntgenstrahlen in sichtbares Licht umzuwandeln, das dann unter Verwendung einer 10-fachen Mikroskopobjektivlinse (NA 0,3) auf den sCMOS-Sensor gerichtet wurde.Der sCMOS-Detektor war ein Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) mit einer Arraygröße von 2048 × 2048 Pixeln und einer nativen Pixelgröße von 6,5 × 6,5 &mgr;m.Dieser Aufbau führte zu einer effektiven isotropen Pixelgröße von 0,51 µm und einem Sichtfeld von ungefähr 1,1 mm × 1,1 mm.Eine Belichtungsdauer von 100 ms wurde gewählt, um das Signal-Rausch-Verhältnis der magnetischen Partikel außerhalb und innerhalb der Atemwege zu maximieren und gleichzeitig Bewegungsartefakte durch die Atmung zu minimieren.Für die In-vivo-Studien wurde ein schneller Röntgenverschluss in den Röntgenstrahlengang platziert, um die Strahlendosis zu begrenzen, indem der Röntgenstrahl zwischen den Aufnahmen blockiert wurde.LV-Vektoren wurden in keiner SPring-8 PB-PCXI-Bildgebungsstudie verwendet, da die BL20XU-Bildgebungskabine nicht für die Biosicherheitsstufe 2 zertifiziert ist.Stattdessen haben wir eine Reihe von MP mit gut charakterisierten Eigenschaften ausgewählt, die von zwei kommerziellen Anbietern erhältlich sind – um eine Reihe von Größen, Materialien, Eisenkonzentrationen und Anwendungen abzudecken –, um zunächst zu verstehen, wie das Magnetfeld die MP-Bewegung in Glaskapillarröhrchen beeinflusst, und dann auf spannungsführenden Atemwegsoberflächen.Die MP hatten eine Größe von 0,25 bis 18 μm und wurden aus einer Reihe von Materialien hergestellt (siehe Tabelle 1), jedoch war die Zusammensetzung jeder Probe, einschließlich der Größe der magnetischen Partikel innerhalb der MP, nicht bekannt.Basierend auf unseren umfangreichen MCT-Studien19,20,21,23,24 erwarteten wir, dass MP mit einer Größe von nur 5 μm auf der Luftröhrenoberfläche sichtbar sein würde, wobei die Sichtbarkeit durch MP-Bewegung verbessert würde, beispielsweise durch Subtraktion aufeinanderfolgender Frames.Einzelne MP mit einer Größe von 0,25 μm waren kleiner als die Auflösung des Bildgebungsaufbaus, aber es wurde vorhergesagt, dass ihr Massenkontrast und die Bewegung der Oberflächenflüssigkeit, in der sie sich nach der Abscheidung befanden, durch PB-PCXI nachweisbar sein würden.Proben von jedem MP aus Tabelle 1 wurden in 20 &mgr;l-Glaskapillarröhrchen mit einem Innendurchmesser von 0,63 mm (Drummond Microcaps, PA, USA) hergestellt.Die korpuskulären Partikel wurden in Wasser geliefert und die CombiMag-Partikel in der proprietären Flüssigkeit des Herstellers.Jedes Röhrchen wurde zur Hälfte mit Flüssigkeit (ca. 11 μl) gefüllt und auf einen Probenhalter gestellt (siehe Abb. 1).Die Glaskapillaren wurden einzeln horizontal auf dem Probentisch in der Abbildungshütte platziert und der Rand der Flüssigkeit lokalisiert.Ein vernickelter Seltenerd-Neodym-Eisen-Bor (NdFeB)-Magnet (N35, Kat.-Nr. LM1652, Jaycar Electronics, Australien) mit 19 mm Durchmesser (28 mm Länge) und einer remanenten Magnetisierung von 1,17 Tesla wurde an einer separaten Translationsstufe angebracht, um dies zu ermöglichen seine Position kann während der Bildgebung aus der Ferne geändert werden.Die Aufnahme von Röntgenbildern begann, während sich der Magnet etwa 30 mm über der Probe befand, wobei Bilder mit einer Rate von 4 Bildern pro Sekunde aufgenommen wurden.Während der Bildgebung wurde der Magnet näher an das Glaskapillarröhrchen herangebracht (ca. 1 mm entfernt) und dann entlang des Röhrchens verschoben, um die Auswirkungen von Feldstärke und Position beurteilen zu können.In-vitro-Bildgebungsaufbau mit einer MP-Probe, die in einem Glaskapillarröhrchen auf dem x-y-Translationstisch der Probe enthalten ist.Der Weg des Röntgenstrahls ist mit einer roten gestrichelten Linie markiert.Sobald die In-vitro-Sichtbarkeit des MP bestimmt war, wurde eine Auswahl davon in vivo an weiblichen Wildtyp-Albino-Wistar-Ratten (~ 12 Wochen alt, ~ 200 g) getestet.Ratten wurden mit einer Mischung aus 0,24 mg/kg Medetomidin (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3,2 mg/kg Midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) und 4 mg/kg Butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika Pharma) anästhesiert , Japan) durch intraperitoneale Injektion.Nach der Anästhesie wurden die Ratten auf die Bildgebung vorbereitet, indem das Fell um die Luftröhre entfernt, ein Endotrachealtubus (ET; 16 Ga iv-Kanüle, Terumo BCT) eingeführt und sie in Rückenlage an einem speziell entwickelten Bildgebungsbrett mit einer Wärmepackung befestigt wurden um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten22.Diese Bildgebungsplatte wurde dann leicht geneigt an der Probentranslationsstufe in der Bildgebungshütte befestigt, um die Luftröhre in den Röntgenbildern horizontal auszurichten, wie in 2a gezeigt.(a) In-vivo-Bildgebungsaufbau im SPring-8-Bildgebungsstall, wobei der Weg des Röntgenstrahls mit einer roten gestrichelten Linie markiert ist.(b,c) Die Magnetpositionierung über der Trachea wurde aus der Ferne mit zwei orthogonal montierten IP-Kameras durchgeführt.Auf der linken Seite des Bildschirmbildes sind die Drahtschlaufe, die den Kopf sichert, und die Einführkanüle in Position innerhalb des ET-Tubus zu sehen.Ein fernbetätigtes Spritzenpumpensystem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL), das eine 100-μl-Glasspritze verwendet, wurde über eine 30-Ga-Nadel mit einem PE10-Schlauch (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) verbunden.Der Schlauch wurde markiert, um sicherzustellen, dass sich die Spitze beim Einführen in den ET-Tubus an der richtigen Stelle in der Trachea befand.Unter Verwendung der Mikropumpe wurde der Spritzenkolben zurückgezogen, während die Röhrchenspitze in die abzugebende MP-Probe eingetaucht war.Der beladene Zufuhrschlauch wurde dann in den Endotrachealtubus eingeführt, wobei die Spitze so platziert wurde, dass sie innerhalb des erwarteten stärksten Teils des angelegten Magnetfelds lag.Die Bildaufnahme wurde mit einem Atmungsdetektor gesteuert, der mit unserer Arduino-basierten Timing-Box verbunden war, wobei alle Signale (z. B. Temperatur, Atmung, Öffnen/Schließen des Verschlusses und Bildaufnahme) mit einem Powerlab und LabChart (AD Instruments, Sydney, Australien)22 aufgezeichnet wurden .Zwei IP-Kameras (Panasonic BB-SC382), die in etwa 90° zueinander angeordnet waren, wurden verwendet, um die Position des Magneten relativ zur Luftröhre während der Bildgebung zu überwachen, wenn das Bildgebungsgehäuse nicht zugänglich war (Abb. 2b, c).Um Bewegungsartefakte zu minimieren, wurde während des Flussplateaus am Ende der Exspiration ein Bild pro Atemzug aufgenommen.Der Magnet war an einer zweiten Stufe befestigt, die von außerhalb des Bildgebungsgehäuses entfernt positioniert werden konnte.Eine Vielzahl von Magnetpositionen und -konfigurationen wurde getestet, darunter: in einem Winkel von ~ 30° über der Luftröhre angebracht (die in den Fig. 2a und 3a gezeigte Konfiguration);ein Magnet über dem Tier und der andere darunter mit anziehenden Polen (Abb. 3b);ein Magnet über dem Tier und der andere darunter, mit abstoßenden Polen (Abb. 3c);und ein Magnet über und senkrecht zur Luftröhre (Abb. 3d).Sobald das Tier und der Magnet konfiguriert waren und das zu testende MP in die Spritzenpumpe geladen wurde, wurde eine 50-μl-Dosis mit einer Geschwindigkeit von 4 μl/s abgegeben, während Bilder erfasst wurden.Der Magnet wurde dann vor und zurück bewegt, entweder entlang der Trachea oder quer über die Trachea, während weiterhin Bilder aufgenommen wurden.Magnetkonfigurationen für die In-vivo-Bildgebung (a) Einzelmagnet über der Trachea in einem Winkel von ~ 30 °, (b) zwei Magnete zum Anziehen, (c) zwei Magnete zum Abstoßen, (d) ein einzelner Magnet darüber und senkrecht dazu die Luftröhre.Der Betrachter blickt vom Mund durch die Luftröhre nach unten in Richtung Lunge, wobei der Röntgenstrahl in die linke Seite der Ratte und auf der rechten Seite austritt.Der Magnet wurde entweder längs des Atemwegs oder links und rechts über der Luftröhre in Richtung des Röntgenstrahls bewegt.Wir versuchten auch, die Sichtbarkeit und das Verhalten der Partikel in den Atemwegen zu bestimmen, wenn keine verwirrenden Atem- und Herzbewegungen vorhanden waren.Daher wurden die Tiere am Ende des Bildgebungszeitraums durch eine Pentobarbital-Überdosis (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg/kg ip) human getötet.Einige Tiere wurden an Ort und Stelle auf der Bildgebungsplattform belassen, und sobald die Atmung und der Herzschlag aufhörten, wurde das Bildgebungsverfahren wiederholt, wobei eine zusätzliche Dosis von MP hinzugefügt wurde, falls keine auf der Atemwegsoberfläche sichtbar blieb.Die erfassten Bilder wurden flach- und dunkelfeldkorrigiert und dann mithilfe benutzerdefinierter Skripte, die in MATLAB (R2020a, The Mathworks) geschrieben wurden, zu Filmen zusammengesetzt (20 Bilder pro Sekunde; 15–25 × normale Geschwindigkeit, abhängig von der Atemfrequenz).Alle Studien zur Abgabe von LV-Genvektoren wurden an der Labortierforschungseinrichtung der University of Adelaide durchgeführt und waren darauf ausgelegt, die Ergebnisse der SPring-8-Experimente zu nutzen, um zu beurteilen, ob die Abgabe von LV-MP in Gegenwart eines Magnetfelds die In-vivo-Situation verstärkt Gentransfer.Um die Wirkung des MP und des Magnetfelds zu beurteilen, wurden zwei Gruppen von Tieren behandelt: eine mit LV-MP dosiertem Magneten und die andere eine Kontrollgruppe, die LV-MP ohne den Magneten erhielt.Der LV-Genvektor wurde unter Verwendung zuvor beschriebener Verfahren hergestellt25,26.Der LacZ-Vektor exprimierte ein nukleär lokalisiertes β-Galactosidase-Gen, angetrieben durch den konstitutiven MPSV-Promotor (LV-LacZ), der in transduzierten Zellen ein blaues Reaktionsprodukt erzeugt, das im Lungengewebe en face und in histologischen Schnitten sichtbar ist.Die Titerung wurde in Zellkultur durch manuelles Zählen der Anzahl von LacZ-positiven Zellen mit einem Hämocytometer durchgeführt, um den Titer in TU/ml zu berechnen.Der Vektor wurde gefroren bei –80 °C gelagert, kurz vor der Verwendung aufgetaut und vor der Lieferung durch Mischen im Verhältnis 1:1 und Inkubieren auf Eis für mindestens 30 Minuten mit dem CombiMag konjugiert.Normale Sprague-Dawley-Ratten (n = 3/Gruppe, ~ 2–3 Monate alt) wurden mit einer Mischung aus 0,4 mg/kg Medetomidin (Domitor, Ilium, Australien) und 60 mg/kg Ketamin (Ilium, Australien) intraperitoneal ( ip) Injektion und wurden nicht-chirurgisch oral mit einer 16 Ga iv Kanüle intubiert.Um sicherzustellen, dass das tracheale Atemwegsgewebe für die LV-Transduktion empfänglich war27, wurde es unter Verwendung unseres zuvor beschriebenen mechanischen Perturbationsprotokolls konditioniert, bei dem die tracheale Atemwegsoberfläche axial mit einem Drahtkorb gerieben wurde (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115 -UDH, Cook Medical, USA) für 30 s28.Die tracheale LV-MP-Dosierung wurde dann in einer Biosicherheitswerkbank ~ 10 min nach der Perturbation durchgeführt.Das in diesem Experiment verwendete Magnetfeld wurde in ähnlicher Weise wie für die In-vivo-Röntgenbildgebungsstudien konfiguriert, wobei derselbe Magnet mit einer Retortenstativklemme über der Luftröhre gehalten wurde (Abb. 4).Ein 50-μl-Volumen (2 × 25-μl-Aliquots) von LV-MP wurde in die Trachea (n = 3 Tiere) unter Verwendung einer Pipette mit einer Gelspitze, wie zuvor beschrieben, abgegeben25.Die Kontrollgruppe (n = 3 Tiere) erhielt das gleiche LV-MP, aber der Magnet wurde nicht verwendet.Nachdem die Flüssigkeitsabgabe abgeschlossen war, wurde die Kanüle vom ET-Rohr entfernt und das Tier wurde extubiert.Der Magnet blieb für 10 min an Ort und Stelle, danach wurde er entfernt.Ratten erhielten eine subkutane Dosis von Meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australien) und dann wurde die Anästhesie mit einer ip-Injektion von 1 mg/kg Atipamezolhydrochlorid (Antisedan, Zoetis, Australien) aufgehoben.Die Ratten wurden warm gehalten und überwacht, bis die Erholung von der Anästhesie abgeschlossen war.LV-MP-Lieferaufbau in einer Biosicherheitswerkbank.Der hellgraue Luer-Ansatz des ET-Tubus ragt aus dem Mund heraus, wobei die gezeigte Gelspitze der Pipette über den ET-Tubus bis zur gewünschten Tiefe in die Luftröhre eingeführt ist.Eine Woche nach dem LV-MP-Dosierungsverfahren wurden die Tiere auf humane Weise durch Inhalation von 100 % CO2 getötet, und die LacZ-Expression wurde unter Verwendung unserer Standard-X-Gal-Verarbeitungsmethode bewertet29.Die drei am weitesten kaudal gelegenen Knorpelringe wurden entfernt, um sicherzustellen, dass mechanische Beschädigungen oder Flüssigkeitsretention durch die Platzierung des Endotrachealtubus nicht in die Analyse einbezogen wurden.Jede Trachea wurde der Länge nach aufgeschnitten, um zwei Hälften für die Analyse herzustellen, und diese wurden zur Darstellung der lumenalen Oberflächen unter Verwendung von Minutien-Stiften (Fine Science Tools) in eine Schale mit Silikonelastomer (Sylgard, Dow Inc.) gesteckt.Die Verteilung und das Muster der transduzierten Zellen wurde durch En-Face-Fotografie unter Verwendung eines Nikon-Mikroskops (SMZ1500) mit einer DigiLite-Kamera und TCapture-Software (Tucsen Photonics, China) bestätigt.Die Bilder wurden mit 20-facher Vergrößerung aufgenommen (die höchste Einstellung, die die gesamte Breite der Luftröhre umfasste) und die gesamte Länge der Luftröhre wurde schrittweise abgebildet, wobei sichergestellt wurde, dass zwischen den einzelnen Bildern eine ausreichende Überlappung bestand, um ein „Stitching“ der Bilder zu ermöglichen.Bilder von jeder Trachea wurden dann unter Verwendung des Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) zu einem einzigen zusammengesetzten Bild zusammengesetzt, wobei der planare Bewegungsalgorithmus verwendet wurde.Der Bereich der LacZ-Expression innerhalb der trachealen zusammengesetzten Bilder von jedem Tier wurde unter Verwendung eines automatisierten MATLAB-Skripts (R2020a, MathWorks) wie zuvor beschrieben28 unter Verwendung von Einstellungen von 0,35 < Farbton < 0,58, Sättigung > 0,15 und Wert < 0,7 quantifiziert.Für jedes zusammengesetzte Bild in GIMP v2.10.24 wurde manuell eine Maske generiert, indem der Umriss des Gewebes nachgezeichnet wurde, um die Bestimmung des Gewebebereichs zu ermöglichen und falsche Erkennungen von außerhalb des Trachealgewebes zu verhindern.Der gefärbte Bereich von allen zusammengesetzten Bildern von jedem Tier wurde summiert, um einen gesamten gefärbten Bereich für dieses Tier zu erzeugen.Der gefärbte Bereich wurde dann durch den gesamten Maskenbereich dividiert, um einen normalisierten Bereich zu erzeugen.Jede Luftröhre wurde in Paraffin eingebettet und 5 &mgr;m-Schnitte wurden geschnitten.Die Schnitte wurden 5 Minuten lang mit neutralem Echtrot gegengefärbt, und die Bilder wurden mit einem Nikon Eclipse E400-Mikroskop, einer DS-Fi3-Kamera und der NIS-Elemente-Erfassungssoftware (Version 5.20.00) aufgenommen.Alle statistischen Analysen wurden in GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) durchgeführt.Die statistische Signifikanz wurde auf p ≤ 0,05 festgelegt.Die Normalität wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test verifiziert, und die LacZ-Färbungsunterschiede wurden mit einem ungepaarten t-Test bewertet.Die sechs in Tabelle 1 beschriebenen MP wurden alle mit PCXI untersucht, mit der in Tabelle 2 beschriebenen Sichtbarkeit. Die zwei Polystyrol-MP (MP1 und MP2; 18 μm bzw. 0,25 μm) waren unter PCXI nicht sichtbar, aber die verbleibenden Proben konnten alle identifiziert werden (Beispiele in Abb. 5).MP3 und MP4 (10–15 % Fe3O4; 0,25 μm bzw. 0,9 μm) waren schwach sichtbar.Obwohl es einige der kleinsten getesteten Partikel enthielt, war MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 μm) am sichtbarsten.MP6, das CombiMag-Produkt, war sehr schwer zu erkennen.In allen Fällen wurde unsere Fähigkeit, den MP zu erkennen, dramatisch verbessert, indem der Magnet parallel zur Kapillare vor und zurück verschoben wurde.Wenn sich der Magnet vom Kapillarröhrchen entfernt befand, dehnten sich die Partikel in langen Fäden aus, aber wenn der Magnet näher gebracht und die Magnetfeldstärke erhöht wurde, verkürzten sich die Fäden, als die Partikel zur oberen Oberfläche der Kapillare wanderten (siehe Zusatzvideo S1: MP4), wodurch die Partikeldichte an dieser Oberfläche erhöht wird.Wenn im Gegensatz dazu der Magnet von der Kapillare wegbewegt wurde, wodurch die Feldstärke verringert wurde, ordnete sich das MP in langen Fäden neu an, die sich von der oberen Kapillaroberfläche weg erstreckten (siehe Zusatzvideo S2: MP4).Die Partikel bewegten sich für eine kurze Zeit weiter, nachdem der Magnet aufgehört hatte, sich zu bewegen, als sie eine Gleichgewichtsposition erreichten.Wenn sich der MP auf die obere Oberfläche der Kapillare zu und von ihr weg bewegte, zogen die magnetischen Teilchen oft Trümmer mit sich durch die Flüssigkeit.Die Sichtbarkeit des MP unter PCXI variierte deutlich zwischen den Proben.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 und (d) MP6.Alle hier gezeigten Bilder wurden mit dem Magneten ~ 10 mm direkt über dem Kapillarrohr aufgenommen.Die ausgeprägten großen kreisförmigen Formen sind im Kapillarröhrchen eingeschlossene Luftblasen und zeigen deutlich die schwarz-weißen Ränder, die für die Phasenkontrastbildgebung charakteristisch sind.Rote Kästchen enthalten eine kontrastverstärkte Vergrößerung.Beachten Sie, dass der Durchmesser des Magnetschemas in allen Figuren nicht maßstabsgetreu ist und ~ 100 × größer ist als gezeigt.Als der Magnet entlang der Oberseite des Kapillarröhrchens nach links und rechts verschoben wurde, änderte sich der Winkel der MP-Saiten, um sich zum Magneten hin auszurichten (siehe Fig. 6), wodurch die magnetischen Feldlinien nachgezeichnet wurden.Für MP3-5 erreichten die Fäden einen Schwellenwinkel, nach dem die Partikel entlang der oberen Oberfläche des Kapillarröhrchens gezogen wurden.Dies führte oft dazu, dass sich die MP zu größeren Gruppen zusammenschlossen, die sich in der Nähe der stärksten Magnetfelder niederließen (siehe ergänzendes Video S3: MP5).Dies war auch besonders auffällig bei der Bildgebung nahe dem Ende der Kapillare, was dazu führte, dass sich das MP bündelte und an der Fluid-Luft-Grenzfläche konzentriert wurde.Die Partikel in MP6 waren schwieriger zu erkennen als in MP3-5, und als der Magnet entlang der Kapillare bewegt wurde, wurden diese Partikel nicht mitgeschleppt, sondern die MP-Strings dissoziiert, wobei die Partikel im Sichtfeld blieben (siehe Zusatzvideo S4: MP6).In einigen Fällen, wenn das angelegte Magnetfeld reduziert wurde, indem der Magnet sehr weit von der Abbildungsstelle wegbewegt wurde, fielen alle verbleibenden MP langsam unter der Schwerkraft auf die Bodenfläche des Röhrchens, während sie in Fäden verblieben (siehe Zusatzvideo S5: MP3 ).Als der Magnet nach rechts über das Kapillarrohr verschoben wurde, änderte sich der Winkel der MP-Saiten.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 und (d) MP6.Rote Kästchen enthalten eine kontrastverstärkte Vergrößerung.Beachten Sie, dass die ergänzenden Videos informativ sind, da sie wichtige Partikelstrukturen und dynamische Informationen offenbaren, die in diesen statischen Bildern nicht visualisiert werden können.Unsere Tests haben gezeigt, dass das langsame Hin- und Herbewegen des Magneten entlang der Luftröhre die Visualisierung des MP vor dem komplexen sich bewegenden Hintergrund in vivo unterstützt.Da die Polystyrolkügelchen (MP1 und MP2) im Kapillarröhrchen nicht sichtbar waren, wurden sie nicht in vivo getestet.Jeder der verbleibenden vier MP wurde in-vivo getestet, wobei die Längsachse des Magneten über der Trachea in einem Winkel von ~ 30° zur Vertikalen konfiguriert war (siehe Abb. 2b und 3a), da dies zu längeren MP-Strängen und stärkeren Effekten führte als mit dem Magnet end-on konfiguriert.MP3, MP4 und MP6 konnten bei keinem der lebenden Tiere in der Luftröhre nachgewiesen werden.Als die Atemwege der Ratte abgebildet wurden, nachdem die Tiere auf humane Weise getötet worden waren, waren die Partikel immer noch nicht sichtbar, selbst wenn zusätzliche Volumina mit der Spritzenpumpe hinzugefügt wurden.MP5, das den höchsten Eisenoxidgehalt aufwies, war das einzige sichtbare Partikel und wurde daher zur Bewertung und Beschreibung des In-vivo-Verhaltens des MP verwendet.Das Platzieren des Magneten über der Trachea während der MP-Abgabe führte dazu, dass sich viele, aber nicht alle MP innerhalb des Sichtfelds aggregierten.Die Abgabe der Partikel in die Luftröhre wurde am besten bei einem human getöteten Tier beobachtet.Abbildung 7 und ergänzendes Video S6: MP5 zeigt die schnelle magnetische Erfassung und Ausrichtung der Partikel in Fäden auf der ventralen Luftröhrenoberfläche, was zeigt, dass MP zu gewünschten Regionen der Luftröhre geleitet werden könnte.Bei der Suche weiter distal entlang der Trachea nach der MP-Abgabe wurden einige MP näher an der Carina gefunden, was darauf hinweist, dass die Magnetfeldstärke nicht ausreichte, um alle MP zu sammeln und zurückzuhalten, als sie während der Flüssigkeit den Bereich der maximalen Magnetfeldstärke passierten Lieferung.Nichtsdestotrotz war die MP-Konzentration nach der Entbindung um die Bildgebungsregion herum höher, was darauf hindeutet, dass viele MP in den Atemwegsregionen zurückgehalten wurden, wo die angelegte Magnetfeldstärke am höchsten war.Bilder von (a) vor und (b) unmittelbar nach der Abgabe von MP5 in die Luftröhre einer kürzlich eingeschläferten Ratte, wobei sich der Magnet direkt über der Bildgebungsregion befindet.Die Bildgebungsregion liegt zwischen zwei Knorpelringen.Vor der MP-Verabreichung war etwas Flüssigkeit in den Atemwegen vorhanden.Die rote Box enthält eine kontrastverstärkte Vergrößerung.Diese Bilder stammen aus dem Video, das im Zusatzvideo S6: MP5 gezeigt wird.Das Verschieben des Magneten entlang der Luftröhre in vivo führte dazu, dass die MP-Stränge den Winkel innerhalb der Atemwegsoberfläche auf ähnliche Weise änderten wie im Kapillarröhrchen (siehe Abb. 8 und Zusatzvideo S7: MP5).In unseren Studien konnte das MP jedoch nicht entlang der lebenden Atemwegsoberfläche gezogen werden, wie dies mit dem Kapillarröhrchen möglich war.In einigen Fällen wurden die MP-Stränge länger, wenn der Magnet nach links und rechts bewegt wurde.Interessanterweise stellten wir auch fest, dass die Partikelstränge, als der Magnet in Längsrichtung entlang der Luftröhre verschoben wurde, die Tiefe der Schicht der Oberflächenflüssigkeit zu verändern schienen und sie ausdehnten, als sich der Magnet direkt über ihm bewegte und die Partikelstränge in eine vertikale Position gedreht wurden (siehe Ergänzung Video S7: MP5 bei 0:09, unten rechts).Wenn der Magnet über die Oberseite der Luftröhre in Querrichtung verschoben wurde (dh nach links oder rechts vom Tier statt entlang der Länge der Luftröhre), änderte sich das charakteristische Bewegungsmuster.Die Partikel waren bei Bewegung noch deutlich sichtbar, aber die Spitzen der Partikelstränge wurden sichtbar, als sich der Magnet von der Luftröhre entfernte (siehe Zusatzvideo S8: MP5, ab 0:08).Dies stimmte mit dem MP-Verhalten überein, das wir unter angelegten Magnetfeldern in den Glaskapillaren beobachteten.Beispielbilder, die MP5 in der Luftröhre einer lebenden anästhesierten Ratte zeigen.Bilder wurden aufgenommen (a) mit dem Magneten oberhalb und links von der Trachea und dann (b) nachdem der Magnet nach rechts bewegt wurde.Die roten Kästchen enthalten kontrastverstärkte Vergrößerungen.Diese Bilder stammen aus dem Video, das im Zusatzvideo S7: MP5 gezeigt wird.Wenn zwei Magnetpole von Nord nach Süd (d. h. zum Anziehen; Abb. 3b) über und unter der Luftröhre konfiguriert wurden, erschienen die MP-Fäden länger und befanden sich eher an den Seitenwänden der Luftröhre als auf der dorsalen Luftröhrenoberfläche (siehe Ergänzung Video S9: MP5).Natl.Akad.Wissenschaft.Artikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarTechnik.Artikel CAS PubMed Google ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarAuflösungArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarBin.Artikel CAS PubMed Google ScholarBin.Artikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarWissenschaft.Med.biol.Wissenschaft.Artikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarAuflösungArtikel PubMed PubMed CentralGoogle ScholarArtikel CAS PubMed Google ScholarArtikel PubMed PubMed CentralGoogle 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